专题解说：原代细胞培养技术（11.11周三）
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顾名思义，从体内分离出来的组织或细胞的第一次培养称为原代培养。更成熟的概念是，凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。细胞的纯化或细胞克隆技术是细胞培养工作的基础。
原代细胞培养的原理
将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
原代细胞培养的应用
(1)为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段;
(2)为传代培养创造条件;
(3)服务于临床实践，用于药物筛选等。
原代细胞培养的步骤：取材→分离→培养和维持
1、取材
人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，直接影响细胞的体外培养。
(1) 取材的基本要求
① 取材要注意新鲜和保鲜
② 应严格无菌
③ 防止机械损伤
④ 去除无用组织和避免干燥
⑤ 应注意组织类型、分化程度、年龄等
⑥ 作好记录
(2)各类组织的取材技术
① 皮肤和粘膜的取材
主要取自于手术过程中的皮片，方法似外科取断层皮片手术操作，但面积一般2~4平方厘米。
② 内脏和实体瘤的取材
内脏除消化道外基本是无菌的，但取材时要明确和熟悉所需组织的类型和部位，实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域，要避开破溃、坏死液化部分，以防污染，尽量去除混杂的结缔组织。
③ 血液细胞的取材
血细胞、淋巴细胞的取材，一般多抽取静脉外周血，或从淋巴组织中(如脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等)分离细胞，取材时应注意抗凝。
④ 骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材
严格无菌，注意抗凝，还要尽快分离培养，离心后，用无钙、镁PBS洗两次，再用培养液洗一次后即可培养，不宜低温存放。
⑤ 动物组织取材
I 鼠胚组织取材
首先用引颈或气管窒息致死法处死孕期合适的动物，然后将其整个浸泡在含有75%酒精的烧杯中，5分钟后(注意时间不能太长，以避免酒精从口或其他通道进入体内，影响组织活力)，取出动物，在消毒过的木板上可用无菌的图钉或大头针固定四肢，切开皮肤，用无菌操作法解剖取胚或用无菌止血钳挟起皮肤、用无菌眼科剪沿躯干中部环形剪开皮肤，用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾，把动物反包，暴露躯干，然后再固定，更换无菌解剖器材，采用无菌操作法解剖取出胚胎。
II 幼鼠胚肾(或肺)取材
幼鼠采用上述方法处死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切开游离毛皮并拉开至两侧：然后采用无菌法打开胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先将背部毛皮切开游离并拉向两侧，然后采用无菌法从背部打开腹腔取肾。
⑥ 鸡(鸭)鸟类胚胎组织取材步骤
1、取孵化至适当胚龄(9~12天)的胚蛋，用照蛋灯在暗处灯检，若有丰富血管、胚体有运动的胚蛋，说明胚体发育良好，并用有色笔划出气室和胚体位置。
2、将胚蛋置于蛋架上，先用温水清洗蛋壳，再用75%酒精棉球擦干;
经碘酒、75%酒精消毒后，在无菌条件下采用无菌法用剪刀或镊子打开气室，沿气室边缘去除蛋壳;
3、用眼科镊撕去壳膜，暴露出鸡胚;
4、用弯头镊轻挑起胚头，取出胚胎，放入无菌平皿中，解剖取材。
2、分离
人或动物体内(或胚胎组织)由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来。
(1)悬浮细胞的分离方法
组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟。经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。
(2)实体组织材料的分离方法
对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法(物理裂解)和消化分离法。
① 机械分散法
特点:简便、快速,但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差,适用于处理纤维成分少的软组织。
② 消化分离法
组织消化法是把组织剪切成较小团块(或糊状)，应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。
Ⅰ 酶消化分离法
酶消化分离法常采用胰蛋白酶(Corning 25-053-CI)和胶原酶(Sigma/Life)
胰蛋白酶分散原理：胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开。
影响胰蛋白酶作用的主要因素：
细胞类型、酶的活力、酶的浓度、温度、pH、无机盐离子、消化时间
胶原酶(Collagenase，Sigma)消化法
胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用。适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用。
表1 胰蛋白酶和胶原酶生物活性的差别
项 目 | 胰蛋白酶 | 胶原酶 |
消化特性 | 适用于消化软组织 | 适用于消化纤维多的组织 |
用 量 | 0.01%~0.5% | 0.1~0.3mg/mL（200u/mL） |
消化时间 | 0.5~2小时（小块） | 1~12小时 |
pH | 8~9 | 6.5~7.0 |
作用强度 | 强烈 | 缓和 |
细胞影响 | 时间过长有影响 | 无大影响 |
血清、钙、镁离子 | 有影响 | 无影响 |
表2 胰蛋白酶和胶原酶在不同温度下消化各种组织小块时所需时间(小时)(0.5～1cm3)
酶 种 类 | 较 硬 组 织 | 软 组 织 | ||||
4℃ 室 温 37℃ | 4℃ 室 温 37℃ | |||||
胰蛋白酶（0.25%） | 24~48 | 1~6 | 1~2 | 12~24 | 1~2 | 0.5~1 |
胶原酶（200u/mL） | 24 | 6 | 6.5 | 12 | 3 | 0.25 |
两者联合（对冲） | 12~46 | 12~24 | 4~12 | 12~24 | 6~12 | 1~2 |
除上述两种最常用的消化酶外，还有链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶
Ⅱ 非酶消化法(EDTA消化法)
EDTA是一种非酶消化物，又称螯合剂或Versene，全名为乙烯二胺四乙酸。常用不含钙、镁离子的PBS配成0.02%的工作液，对一些组织，尤其是上皮组织分散效果好，该化学物质能与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离。
Ⅲ 消化分离法的操作步骤
剪切.加液漂洗.消化.弃去消化液.漂洗.机械分散
Ⅳ 消化分离法的注意事项
组织块必须漂洗2-3次以除去组织中的钙、镁离子和血清对胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。
胰蛋白浓度不宜过高，作用时间不能太长，以避免毒性作用。
消化后组织不仅要尽量弃去消化液，以避免毒性产生，而且动作要轻，避免膨松的细胞随漂洗而丢失。
3、原代细胞的培养和维持
(1)原代细胞的培养方法
原代细胞的培养也叫初代培养是从供体取得组织细胞在体外进行的首次培养，是建立细胞系的第一步，是一项基本技术。
原代细胞最接近和最能反映体内生长特性，适宜用于药物敏感性试验、细胞分化等实验研究。
① 组织块培养法
组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法。其基本方法是将剪成的小组织团块接种于培养瓶(或皿)中，瓶壁可预先涂以胶原薄层，以利于组织块粘着于瓶壁，使周边细胞能沿瓶壁向外生长。
② 消化培养法
③ 悬浮细胞培养法
对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。
④器官培养
器官培养是指从供体取得器官或组织块后，不进行组织分离而直接在体外的特定环境条件下培养，器官培养可保持器官组织的相对完整性，可用于重点观察细胞间的联系、排列情况和相互影响，以及局部环境的生物调节作用。
(2)原代细胞的培养条件
① 静置贴壁细胞(包括半贴壁细胞的培养)培养
a 细胞要通过充分漂洗，以尽量除去消化液的毒性
b 细胞接种时浓度要稍大一些，至少为5×108细胞/L。
c 培养基可用Eagle(MEM Corning 10-010-CVR)或DMEM(Corning 10-013-CVR)培养。
d 胎牛血清浓度为10%-80%。
e 应在37℃5% CO2的培养箱中培养。。
f 在起始的2天中尽量减少振荡，以防止刚贴壁的细胞发生脱落，漂浮。
g 待细胞基本贴壁伸展并逐渐形成网状，应将原代细胞换液
h 用骨髓或外周血中的悬浮细胞经静置培养1周时，应将细胞悬液经低速离心后换液。
② 悬浮细胞的培养要求
a 原代培养时要尽量去除红细胞
b 短期培养，可在含10%小牛血清的RPMI1640培养基中进行
c 细胞浓度可在5-8×109/L范围内，进行分瓶试验。
d 长期培养时，淋巴细胞中要加入生长因子，白血病细胞中要加入少量的原患者血清，以利细胞生长。
f 细胞换液一般每隔3天需半量换液一次
g 细胞传代一般待细胞增殖加快、细胞密度较高时才能进行。
原代细胞培养的首次传代
原代培养后由于悬浮细胞增殖，数量增加甚至达饱和密度;贴壁细胞的相互汇合，使整个瓶底逐渐被细胞覆盖，细胞难以继续生长繁殖，需要进行分瓶培养，这种使原代细胞经分散接种的过程称之为传代。值得注意的是：每次传代细胞在生长和增殖方面受到一定的影响。
首次传代应注意以下几点：
① 细胞生长密度不高时，不能急于传代。
② 原代培养的贴壁细胞需控制消化时间。
③ 吹打已消化的细胞应减少机械损伤。
④ 首次传代时细胞接种数量要多一些。
⑤ 首次传代培养的pH应偏低些。小牛血清浓度可加大至15%～20%左右
原代细胞的维持
① 贴壁细胞长成网状或基本单层时，未达到饱和密度，需采取换液方式来更新营养成分以满足细胞继续生长繁殖的需要。
② 换入等量完全培养基或换成含2%小牛血清的维持液。
③ 悬浮细胞细胞培养基中不仅会发生转化而且会发生分裂繁殖，此时培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求，需进行换液。通常采用半量换液的方法。